Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.

Investigating the thymopoiesis stimulating property of interleukin-21 in aging mice

La vaccination est largement utilisée pour la génération de lymphocytes T spécifiques contre les tumeurs. Malheureusement, cette stratégie n'est pas adaptée aux personnes âgées car leur thymus régresse avec l'âge conduisant ainsi à une baisse dans la production de cellules T et à l'accumulation de cellules immunitaires âgées ayant des défauts liés à leurs stimulations. Comme il a été démontré auparavant que L’IL-21 est capable d’induire des fonctions thymiques, nous avons émis l’hypothèse que l’injection d’IL-21 à des souris âgées stimulera la thymopoïèse. Nos résultats montrent que l’administration de l’IL-21 augmente le nombre absolu de thymocytes chez les souris âgées et augmente la migration de ces cellules vers la périphérie ou ils contribuent à la diversité du TCR. De plus les cellules T en périphérie expriment un niveau plus élevé de miR181-a, et par conséquent moins de phosphatase comme SHP2, DUSP5/6 qui inhibent le TCR. En vaccinant des souris âgées avec le peptide Trp2, les souris traitées avec l’IL-21 montrent un retard dans la croissance des cellules B16 tumorales. Cette étude montre que l’IL-21 pourrait être utilisé comme stratégie pour le rétablissement du systeme immunitaire chez les personnes âgées.

Caractérisation des interactions établies par la région riche en prolines de la ligase de l’ubiquitine Itch.

Itch est un membre de la famille des ligases de l’ubiquitine de type CWH (C2-WW- HECT) impliqué dans le contrôle de la signalisation inflammatoire, des facteurs de transcription et le tri des récepteurs membranaires. La fonction d’Itch implique généralement sa capacité à induire la dégradation de ses substrats. Pour accomplir cette fonction, Itch doit d’abord interagir avec ses cibles. Itch possède quatre domaines WW lui permettant d’accomplir la majorité de ses fonctions. En plus de ces domaines, Itch possède une PRR (région riche en prolines) unique parmi les ligases CWH. Cette région est bien conservée chez les vertébrés, ce qui suggère son importance. Cette région permet à Itch d’interagir avec des protéines contenant un domaine SH3 (Src homology 3). Plusieurs partenaires SH3 furent identifiés, cependant l’on connait peu de choses concernant la fonction et l’établissement de ces complexes. Dans ce projet, nous avons analysé les propriétés de liaison d’un sous-groupe de protéines à domaine SH3 impliquées dans l’endocytose et la signalisation cellulaire. Nos travaux ont permis d’identifier de nouveaux partenaires et aussi de déterminer que différents domaines SH3 ciblent la même région riche en prolines, mais impliquent des résidus distincts. Ces résultats démontrent la variété des propriétés de liaison démontrées par la PRR d’Itch et sa préférence marquée pour l’Endophiline. Parmi les partenaires identifiés, Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) est particulièrement intéressant en raison de son rôle crucial dans la signalisation cellulaire. Nous avons démontré ici qu’Itch ubiquityle Grb2, mais ne cause pas sa dégradation, contrairement à l’Endophiline. Nos travaux démontrent que la PRR d’Itch est versatile quant à ses interactions et leurs conséquences.

Hypophosphatémie après résection hépatique

Introduction : L’hypophosphatémie survient couramment après hépatectomie partielle. La régénération du foie était l’explication initiale. Cependant, les pertes rénales de phosphate observées récemment suggèrent que l’hypophosphatémie est probablement d’origine rénale. Nous avons donc mesuré la fraction d’excrétion urinaire de phosphate (FePO4) après hépatectomie partielle et nous avons étudié le rôle de la parathormone (PTH) et des phosphatonines dans cette hypophosphatémie. Méthodes : Les taux sériques de phosphate, de calcium ionisé, de PTH intacte, de « fibroblast growth factor- 23 » (FGF-23) intact et carboxyle-terminal, de FGF-7, de la « frizzled-related protein-4 » (FRP-4) et de HCO3- ainsi que le pH et la FePO4 ont été mesurés avant la chirurgie et aux jours postopératoires (po) 1, 2, 3, 5 et 7, chez 18 patients ayant subi une résection hépatique partielle. Résultats : Le phosphate sérique était à son plus bas niveau (0,66 ± 0,33 mmol/l; p < 0,001) au jour po 2. La FePO4 culminait à 25,07 ± 2,26 % au jour po 1 (p < 0,05) et était associée avec le taux de la parathormone intacte (r = 0,65; p = 0,006). Le calcium ionisé sérique diminuait à 1,1 ± 0,01 mmol/l, (p < 0,01) en même temps que la parathormone intacte s’élevait à 8,8 ± 0,9 pmol/l, (p < 0,01) au jour po 1; ces deux paramètres étaient inversement corrélés (r = -0,062; p = 0,016). Le FGF-23 intact atteignait son plus bas niveau à 7,8 ± 6,9 pg/ml (p < 0,001), au jour po 3; les valeurs de FGF-23 étaient corrélées avec la diminution du phosphate sérique aux jours po 0, 3, 5 et 7 (p < 0,001). Le FGF-23 carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4 n’étaient pas reliés au phosphate sérique ni à la FePO4. Conclusion : L’hypophosphatémie observée après résection hépatique partielle est liée à une augmentation de la FePO4 qui est sans aucune relation avec les FGF-23 intact ou carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4. La PTH intacte était associée avec la FePO4 uniquement au jour po 1. L’hypophosphatémie après résection hépatique est secondaire à d’autres facteurs non encore identifiés.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Features of neighbourhood environments associated with obesity and related health behaviours in children: using multiple statistical approaches to identify obesogenic environments

Contexte: L'obésité chez les jeunes représente aujourd’hui un problème de santé publique à l’échelle mondiale. Afin d’identifier des cibles potentielles pour des stratégies populationnelles de prévention, les liens entre les caractéristiques du voisinage, l’obésité chez les jeunes et les habitudes de vie font de plus en plus l’objet d’études. Cependant, la recherche à ce jour comporte plusieurs incohérences. But: L’objectif général de cette thèse est d’étudier la contribution de différentes caractéristiques du voisinage relativement à l’obésité chez les jeunes et les habitudes de vie qui y sont associées. Les objectifs spécifiques consistent à: 1) Examiner les associations entre la présence de différents commerces d’alimentation dans les voisinages résidentiels et scolaires des enfants et leurs habitudes alimentaires; 2) Examiner comment l’exposition à certaines caractéristiques du voisinage résidentiel détermine l’obésité au niveau familial (chez le jeune, la mère et le père), ainsi que l’obésité individuelle pour chaque membre de la famille; 3) Identifier des combinaisons de facteurs de risque individuels, familiaux et du voisinage résidentiel qui prédisent le mieux l’obésité chez les jeunes, et déterminer si ces profils de facteurs de risque prédisent aussi un changement dans l’obésité après un suivi de deux ans. Méthodes: Les données proviennent de l’étude QUALITY, une cohorte québécoise de 630 jeunes, âgés de 8-10 ans au temps 1, avec une histoire d’obésité parentale. Les voisinages de 512 participants habitant la Région métropolitaine de Montréal ont été caractérisés à l’aide de : 1) données spatiales provenant du recensement et de bases de données administratives, calculées pour des zones tampons à partir du réseau routier et centrées sur le lieu de la résidence et de l’école; et 2) des observations menées par des évaluateurs dans le voisinage résidentiel. Les mesures du voisinage étudiées se rapportent aux caractéristiques de l’environnement bâti, social et alimentaire. L’obésité a été estimée aux temps 1 et 2 à l’aide de l’indice de masse corporelle (IMC) calculé à partir du poids et de la taille mesurés. Les habitudes alimentaires ont été mesurées au temps 1 à l'aide de trois rappels alimentaires. Les analyses effectuées comprennent, entres autres, des équations d'estimation généralisées, des régressions multiniveaux et des analyses prédictives basées sur des arbres de décision. Résultats: Les résultats démontrent la présence d’associations avec l’obésité chez les jeunes et les habitudes alimentaires pour certaines caractéristiques du voisinage. En particulier, la présence de dépanneurs et de restaurants-minutes dans le voisinage résidentiel et scolaire est associée avec de moins bonnes habitudes alimentaires. La présence accrue de trafic routier, ainsi qu’un faible niveau de prestige et d’urbanisation dans le voisinage résidentiel sont associés à l’obésité familiale. Enfin, les résultats montrent qu’habiter un voisinage obésogène, caractérisé par une défavorisation socioéconomique, la présence de moins de parcs et de plus de dépanneurs, prédit l'obésité chez les jeunes lorsque combiné à la présence de facteurs de risque individuels et familiaux. Conclusion: Cette thèse contribue aux écrits sur les voisinages et l’obésité chez les jeunes en considérant à la fois l'influence potentielle du voisinage résidentiel et scolaire ainsi que l’influence de l’environnement familial, en utilisant des méthodes objectives pour caractériser le voisinage et en utilisant des méthodes statistiques novatrices. Les résultats appuient en outre la notion que les efforts de prévention de l'obésité doivent cibler les multiples facteurs de risque de l'obésité chez les jeunes dans les environnements bâtis, sociaux et familiaux de ces jeunes.

Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

Modulation de la signalisation du récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR-2) par l’ubiquitination

Résumé L’angiogenèse est l’un des processus les plus importants pour le maintien de l’homéostasie de l’oxygène dans les tissus. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, VEGF, joue un rôle primordial dans la réponse angiogénique. Ce facteur de croissance mène à l’activation du récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, VEGFR-2. Suite à une activation du VEGFR-2, plusieurs cascades de signalisation sont activées dans les cellules endothéliales. Afin d’atténuer cette signalisation, le VEGFR-2 est multi-ubiquitiné sur des résidus lysine et de cette manière, il est amené aux voies de dégradation, principalement dans les lysosomes. Cette ubiquitination est induite par l’association de l’ubiquitine ligase (E3) c-Cbl à un résidu tyrosine phosphorylé du domaine C-terminal du récepteur. Dans cette étude, nous avons identifié la tyrosine 1319 comme étant nécessaire pour l’association de c-Cbl au VEGFR-2 et son ubiquitination. Nos résultats démontrent aussi que dans des cellules endothéliales aortiques bovines, BAEC, la surexpression du récepteur mutant Y1319F ralentit la dégradation du VEGFR-2 et induit une activation plus forte et prolongée de la synthétase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS). Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le déroulement de la régulation de la signalisation du VEGFR-2 au niveau intracellulaire. Mots-clés: [Angiogenèse, VEGFR-2, VEGF, c-Cbl, Ubiquitination, Tyrosine 1319, Dégradation]

Utilisation des TIC dans l'enseignement universitaire : influence des facteurs individuels et des facteurs liés à la discipline et à l'organisation

La littérature montre que plusieurs aspects du travail d’universitaire sont influencés tant par la discipline et l’organisation, que par les caractéristiques individuelles des professeurs. Cette recherche vise à explorer l’impact de ces deux premiers facteurs sur l’utilisation des technologies de l’information et des communications (TIC) par les professeurs d’une université de recherche. Les données, recueillies par sondage, ont été analysées à l’aide d’un modèle hiérarchique comprenant deux niveaux, dans lequel 350 professeurs sont nichés dans 42 départements. Le statut professoral, le profil d’adoption des innovations technologiques et la perception de la compétence technologique ont été placés au niveau 1 (individus), alors que le secteur disciplinaire et quatre facteurs organisationnels liés à l’enseignement et à la recherche, ont été placés au niveau 2 (départements). Les résultats montrent que ces variables indépendantes n’influencent pas de la même façon l’utilisation des différentes technologies. Une plus grande partie des différences d’utilisation se situe entre les départements lorsqu’on considère l’utilisation du projecteur en salle de classe. L’utilisation d’équipements en salle de classe relève davantage de facteurs organisationnels que celle des environnements numériques d’apprentissage (ENA). Les résultats montrent par ailleurs que la perception de la compétence technologique et le profil d’adoption des innovations technologiques mesurent des choses différentes. Alors que le profil d’adoption influence dans une plus ou moins grande mesure toutes les utilisations, la perception de la compétence n’a d’impact que sur l’utilisation plus poussée des ressources, soit l’utilisation d’une page web personnelle ou d’une plateforme autre que WebCT. Un clivage entre disciplines molles pures et disciplines dures pures existe, mais seulement lorsqu’on considère l’utilisation des ENA et de la page web personnelle. La plateforme WebCT est associée au secteur des sciences humaines alors que l’utilisation de la page web ou d’ENA autre que WebCT est liée au secteur des sciences pures. Dans les deux cas, l’utilisation des ENA est liée à l’enseignement de premier cycle, c’est à dire à un enseignement de masse.

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

Fonctions de l'oncoprotéine LMO2 déterminées par ses interactions protéiques

La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants.

Caractérisation de nouveaux mécanismes transcriptionnels impliqués dans la biologie osseuse

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des interactions impliquant TFIIH et les domaines de transactivation viraux

Le facteur de transcription IIH (TFIIH) joue un rôle crucial dans la transcription et dans la réparation de l’ADN. La sous-unité Tfb1/p62 (levure et humain) de TFIIH interagit avec de nombreux facteurs de transcription (p53, NFκB, TFIIEα) et de réparation (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). La majorité des interactions avec Tfb1/p62 requiert le domaine d’homologie à la Pleckstrin (PH) localisé dans la région N-terminal de la protéine (2, 3). Ce domaine PH forme des complexes avec des domaines de transactivation acide provenant de protéines cibles impliquées dans la transcription et la réparation de l’ADN. De récentes études ont montré que Tfb1/p62 est une cible pour les protéines virales telles que la protéine VP16 du virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1, la protéine E1 du virus du papillome humain (VPH) et la protéine EBNA-2 du virus Epstein-Barr (EBV) (4, 5). Ces protéines virales interagissent avec la sous-unité Tfb1/p62 par un domaine de transactivation acide suggérant une interaction similaire à ce qui est observé chez les facteurs de transcription humains comme p53. Ce mémoire présente une caractérisation structurelle et fonctionnelle du complexe formé par la protéine virale EBNA2 et la protéine humaine Tfb1/p62. L’analyse est faite en utilisant le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et une expérience de transactivation chez la levure. Cette étude amène une plus grande compréhension des protéines impliquées dans les maladies comme le lymphome de Burkitt et le lymphome de Hodgkin qui sont souvent associées à l’infection à l’EBV (revue dans (6)) et caractérise une cible potentielle pour un antiviral.

Molecular interactions of arbuscular mycorrhizal fungi with mycotoxin-producing fungi and their role in plant defense responses

Les trichothécènes de Fusarium appartiennent au groupe des sesquiterpènes qui sont des inhibiteurs la synthèse des protéines des eucaryotes. Les trichothécènes causent d’une part de sérieux problèmes de santé aux humains et aux animaux qui ont consommé des aliments infectés par le champignon et de l’autre part, elles sont des facteurs importants de la virulence chez plantes. Dans cette étude, nous avons isolé et caractérisé seize isolats de Fusarium de la pomme de terre infectée naturellement dans un champs. Les tests de pathogénicité ont été réalisés pour évaluer la virulence des isolats sur la pomme de terre ainsi que leur capacité à produire des trichothécènes. Nous avons choisi F. sambucinum souche T5 comme un modèle pour cette étude parce qu’il était le plus agressif sur la pomme de terre en serre en induisant un flétrissement rapide, un jaunissement suivi de la mort des plantes. Cette souche produit le 4,15-diacétoxyscirpénol (4,15-DAS) lorsqu’elle est cultivée en milieu liquide. Nous avons amplifié et caractérisé cinq gènes de biosynthèse trichothécènes (TRI5, TRI4, TRI3, TRI11, et TRI101) impliqués dans la production du 4,15-DAS. La comparaison des séquences avec les bases de données a montré 98% et 97% d'identité de séquence avec les gènes de la biosynthèse des trichothécènes chez F. sporotrichioides et Gibberella zeae, respectivement. Nous avons confrenté F. sambucinum avec le champignon mycorhizien à arbuscule Glomus irregulare en culture in vitro. Les racines de carotte et F. sambucinum seul, ont été utilisés comme témoins. Nous avons observé que la croissance de F. sambucinum a été significativement réduite avec la présence de G. irregulare par rapport aux témoins. Nous avons remarqué que l'inhibition de la croissance F. sambucinum a été associée avec des changements morphologiques, qui ont été observés lorsque les hyphes de G. irregulare ont atteint le mycélium de F. sambucinum. Ceci suggère que G. irregulare pourrait produire des composés qui inhibent la croissance de F. sambucinum. Nous avons étudié les patrons d’expression des gènes de biosynthèse de trichothécènes de F. sambucinum en présence ou non de G. irregulare, en utilisant le PCR en temps-réel. Nous avons observé que TRI5 et TRI6 étaient sur-exprimés, tandis que TRI4, TRI13 et TRI101 étaient en sous-exprimés en présence de G. irregulare. Des analyses par chromatographie en phase-gazeuse (GC-MS) montrent clairement que la présence de G. irregulare réduit significativement la production des trichothécènes par F. sambucinum. Le dosage du 4,15-DAS a été réduit à 39 μg/ml milieu GYEP par G. irregulare, comparativement à 144 μg/ml milieu GYEP quand F. sambucinum est cultivé sans G. irregulare. Nous avons testé la capacité de G. irregulare à induire la défense des plants de pomme de terre contre l'infection de F. sambucinum. Des essais en chambre de croissance montrent que G. irregulare réduit significativement l’incidence de la maladie causée par F. sambucinum. Nous avons aussi observé que G. irregulare augmente la biomasse des racines, des feuilles et des tubercules. En utilisant le PCR en temps-réel, nous avons étudié les niveaux d’expression des gènes impliqué dans la défense des plants de pommes de terre tels que : chitinase class II (ChtA3), 1,3-β-glucanase (Glub), peroxidase (CEVI16), osmotin-like protéin (OSM-8e) et pathogenèses-related protein (PR-1). Nous avons observé que G. irregulare a induit une sur-expression de tous ces gènes dans les racines après 72 heures de l'infection avec F. sambucinum. Nous avons également trové que la baisse provoquée par F. sambucinum des gènes Glub et CEVI16 dans les feuilles pourrait etre bloquée par le traitement AMF. Ceci montre que l’inoculation avec G. irregulare constitut un bio-inducteur systémique même dans les parties non infectées par F. sambucinum. En conclusion, cette étude apporte de nouvelles connaissances importantes sur les interactions entre les plants et les microbes, d’une part sur les effets directs des champignons mycorhiziens sur l’inhibition de la croissance et la diminution de la production des mycotoxines chez Fusarium et d’autre part, l’atténuation de la sévérité de la maladie dans des plantes par stimulation leur défense. Les données présentées ouvrent de nouvelles perspectives de bio-contrôle contre les pathogènes mycotoxinogènes des plantes.

Problèmes de comportement à long terme chez les patients pédiatriques atteints de leucémie lymphoblastique aiguë

Les améliorations dans les protocoles de traitement pour la majorité des cancers pédiatriques ont augmenté de façon marquée les taux de survie. Cependant, des risques élevés de multiples problèmes de santé chez les survivants sont bien documentés. En ce qui concerne spécifiquement les problèmes neuropsychologiques, les principaux facteurs de risque individuels connus à ce jour (l’âge au diagnostic, le genre du patient, l’exposition aux radiations) demeurent insuffisants pour cibler efficacement et prévenir les séquelles à long terme. Les objectifs généraux de cette thèse étaient : 1) la caractérisation des trajectoires individuelles de problèmes de comportement chez une population de patients pédiatriques atteints de leucémie lymphoblastique aiguë; 2) l’identification des principaux déterminants génétiques, médicaux et psychosociaux associés aux problèmes de comportements. Les hypothèses étaient : 1) Il existe une association entre les trajectoires individuelles de problèmes de comportement et a - des facteurs psychosociaux liés au fonctionnement familial, b - des polymorphismes dans les gènes modérateurs des effets thérapeutiques du méthotrexate et des glucocorticoïdes, c - des variables liées aux traitements oncologiques. 2) L'utilisation de modèles statistiques multi-niveaux peut permettre d’effectuer cette caractérisation des trajectoires individuelles et l’identification des facteurs de risque associés. 138 patients pédiatriques (0-18 ans) ayant reçu un diagnostic de leucémie lymphoblastique aiguë entre 1993 et 1999 au CHU Ste-Justine ont participé à une étude longitudinale d’une durée de 4 ans. Un instrument validé et standardisés, le Child Behavior Checklist, a été utilisé pour obtenir un indice de problèmes de comportement, tel que rapporté par la mère, au moment du diagnostic, puis 1, 2, 3 et 4 ans post-diagnostic. Des données génétiques, psychosociales et médicales ont aussi été collectées au cours de cette même étude longitudinale, puis ont été exploitées dans les modélisations statistiques effectuées. Les résultats obtenus suggèrent que les problèmes de comportement de type internalisés et externalisés possèdent des trajectoires et des facteurs de risque distincts. Les problèmes internalisés sont des manifestations de troubles affectifs chez le patient, tels que des symptômes dépressifs ou anxieux, par exemple. Ceux-ci sont très prévalents tôt après le diagnostic et se normalisent par la suite, indiquant des difficultés significatives, mais temporaires. Des facteurs médicaux exacerbant l'expérience de stress, soit le risque de rechute associé au diagnostic et les complications médicales affectant la durée de l'hospitalisation, ralentissent cette normalisation. Les problèmes externalisés se manifestent dans le contact avec autrui; des démonstrations d’agression ou de violence font partie des symptômes. Les problèmes externalisés sont plus stables dans le temps relativement aux problèmes internalisés. Des variables pharmacologiques et génétiques contribuent aux différences individuelles : l'administration d’un glucocorticoïde plus puissant du point de vue des effets pharmacologiques et toxicologiques, ainsi que l’homozygotie pour l’haplotype -786C844T du gène NOS3 sont liés à la modulation des scores de problèmes externalisés au fil du temps. Finalement, le niveau de stress familial perçu au diagnostic est positivement corrélé avec le niveau initial de problèmes externalisés chez le patient, tandis que peu après la fin de la période d’induction, le niveau de stress familial est en lien avec le niveau initial de problèmes internalisés. Ces résultats supportent l'idée qu'une approche holistique est essentielle pour espérer mettre en place des interventions préventives efficaces dans cette population. À long terme, ces connaissances pourraient contribuer significativement à l'amélioration de la qualité de vie des patients. Ces travaux enrichissent les connaissances actuelles en soulignant les bénéfices des suivis longitudinaux et multidisciplinaires pour comprendre la dynamique de changement opérant chez les patients. Le décloisonnement des savoirs semble devenir incontournable pour aspirer dépasser le cadre descriptif et atteindre un certain niveau de compréhension des phénomènes observés. Malgré des défis méthodologiques et logistiques évidents, ce type d’approche est non seulement souhaitable pour étudier des processus dynamiques, mais les travaux présentés dans cette thèse indiquent que cela est possible avec les moyens analytiques actuels.